在NGS建庫過程中,如何避免常見的操作失誤?[新品推薦]

【字體: 時間:2019年07月11日 來源:生物通

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  然而,測序畢竟不同于核酸純化,后者失敗了大不了重做。對測序而言,一個簡單的移液或混合錯誤有可能讓你付出高昂的代價。

2013年,哈佛醫學院的研究人員曾在《Nature Review Genetics》雜志上發表了一篇很有意思的綜述,討論了新一代測序(NGS)實驗中錯誤的來源1。文章指出,在樣品制備和文庫制備環節,用戶操作失誤(user error)都是常有的事,比如貼錯標簽或者加錯溶液。

然而,測序畢竟不同于核酸純化,后者失敗了大不了重做。對測序而言,一個簡單的移液或混合錯誤有可能讓你付出高昂的代價。無論老板是否nice,測序實驗從頭再來的感受肯定不佳,實驗室需要耗費大量的時間和成本,況且有些樣本還很稀有。不過,每次要處理那么多的樣本,即使打起十二分精神,還是難保不出錯。

為了避免操作失誤的發生,賽默飛想到了一個絕妙的好辦法。Invitrogen Collibri系列文庫制備試劑盒中的每種試劑都帶有一種示蹤染料,便于人們清晰觀察文庫制備過程。若你看到溶液均勻變色(比如從藍色變為綠色,圖1),則可以確信相關試劑已添加且徹底混勻。若是漏加了某種試劑,或者沒有混合均勻,則觀察不到預期的顏色變化。


圖1. Collibri PS DNA文庫制備試劑盒的顏色變化

不用擔心,試劑中的惰性染料既不會干擾酶促反應,也不會影響測序結果。最后純化所得的文庫是澄清透明的。這種實時的顏色變化提示,讓操作失誤的可能性大大降低,也讓你對文庫制備的過程充滿信心。

看到這里,你一定想知道,Collibri系列文庫制備試劑盒包含哪些產品,適合哪些應用?其實,針對全基因組測序和轉錄組測序,此系列都有相應的試劑盒提供,均適用于Illumina的高通量測序儀。下面就讓小編來一一介紹。

全基因組測序

▪ Collibri PS DNA文庫制備試劑盒適用于物理片段化的基因組,支持1-1,000 ng的樣本起始量
▪ Collibri PCR-Free PS DNA文庫制備試劑盒同樣適用于物理片段化的基因組,采用PCR-free的實驗方案,支持500-1,000 ng的樣本起始量
▪ Collibri ES DNA文庫制備試劑盒適用于酶法片段化的基因組,支持1-500 ng的樣本起始量
▪ Collibri PCR-Free ES DNA文庫制備試劑盒同樣支持酶法片段化的基因組,采用PCR-free的實驗方案,支持100-500 ng的樣本起始量

根據片段化方式的不同,Collibri DNA文庫制備試劑盒可分為兩大類:物理片段化(PS)和酶法片段化(ES)。物理方法片段化主要是利用機械破碎的方法將基因組隨機打斷,如超聲破碎、霧化等。酶學方法片段化主要利用酶的剪切功能將基因組片段化。酶法片段化方式操作簡單,但物理片段化方式的片段隨機性更好。此外,每種試劑盒都有PCR擴增產品和PCR-free產品可選。

與同類產品相比,Collibri系列文庫制備試劑盒能夠在更短時間內完成建庫。以Collibri PCR-Free PS DNA文庫制備試劑盒為例,文庫制備可在1.5小時內完成,而整個實驗流程的總時間縮短至6.5小時。其他產品一般需要7小時以上,甚至超過10小時。

若起始材料有限,可以選擇PCR方案。不管是PCR-free文庫還是經PCR擴增的文庫,都可以始終保持均一的GC覆蓋度,將GC bias降至最低。即使是“測序困難戶”,如bad promoters或GC含量高達75%的區域,覆蓋度也優于同類產品,包括FFPE樣本。這種高覆蓋度使得突變檢測的靈敏度和準確度得到增強。

經過實驗證實,Collibri DNA文庫制備試劑盒能夠高效地檢測新生突變(De Novo mutations)。不管是PCR方案還是PCR-free方案,它們都能夠高效檢測SNP,對于10 ng及以上的起始DNA樣本量,Collibri PS DNA文庫制備試劑盒的SNP recall高于98.8%(圖2)。此外,即使是低起始量樣本,插入突變檢測的indel recall也高于同類產品。

Collibri DNA文庫制備試劑盒包含了WGS文庫構建所需的所有組分,除了核心酶組分以外,還包括磁珠及經特殊設計的indexed adaptors,無需再單獨購買。試劑盒隨附提供獨特雙端index(UDI)。與傳統的CDI相比,UDI的使用大大降低了標簽串擾(index hopping)的比例。


圖2. 高效檢測突變

全轉錄組測序

Collibri RNA測序建庫流程不同于市面上一般的RNA-Seq建庫流程。RNA經酶片段化后直接與adaptor(含有輔助oligo)連接,之后逆轉錄形成cDNA,最后再通過PCR擴增引入index(圖3)。

這種獨特的建庫流程可保留樣本的復雜度,適用于不同質量的樣本類型,如完整RNA、降解RNA、FFPE樣本等。使用統一引物進行cDNA合成,不會受GC含量的影響,且無需引入隨機Oligo序列,避免檢測SNP或點突變時出現假陽性。


圖3. Collibri RNA測序建庫流程

Collibr™ Stranded RNA文庫制備試劑盒同樣能夠實現快速建庫。包括rRNA去除在內,轉錄組文庫構建可在6.5小時內完成。這樣使得從RNA提取到文庫構建完成的總時間縮短至10.5小時左右。

可選的Collibri H/M/R rRNA Depletion Kit還能從100-1000 ng人、小鼠或大鼠總RNA中高效去除rRNA。與市面上其它rRNA去除方法不同,這種試劑盒基于親和探針雜交和磁珠純化方法,可特異高效地去除rRNA序列。探針的數量和靶向位置均經精心設計,可以去除28S、18S、5.8S、45S、5S、mt16S和mt12S核糖體序列。

Collibri RNA文庫制備試劑盒內包含RNA-Seq文庫構建所需的所有組分,除了片段化酶、RNA末端修飾試劑、Adaptor、連接酶、反轉錄試劑、文庫擴增試劑外,還包含rRNA去除試劑、純化磁珠以及index primer等。

文庫定量

基于qPCR的Collibri文庫定量試劑盒能夠對文庫有效濃度進行準確定量,適合大批量樣本的文庫定量。該試劑盒包含Collibri文庫定量預混液、Collibri DNA標準品和Collibri文庫稀釋緩沖液。在文庫定量時,使用一組6個預先稀釋的DNA參考標準品來生成標準曲線,通過這一標準曲線可測定樣本文庫濃度。

基于Invitrogen™ Platinum™ II Taq 熱啟動DNA聚合酶的qPCR預混液含有靶向Illumina P5和P7 Adaptor序列的引物。Platinum II Taq 熱啟動DNA聚合酶可以均勻擴增GC含量不同和長短各異的DNA片段,因此是定量測序文庫的理想選擇。

與熒光檢測方法相比,qPCR檢測近測定含有P5和P7 Adaptor的文庫片段,因此能夠更加特異和準確地檢測NGS測序文庫。Collibri檢測十分靈敏,可以定量飛摩爾量級的片段文庫。起始量要求極低,通常僅需4 μL稀釋的文庫樣本,濃度>0.0002 pM即可。同樣,顏色指示可降低反應配制期間移液錯誤的風險。

結語

如今,有了Collibri系列建庫試劑盒,你再也不必擔心因少加試劑或加錯試劑而造成的實驗失敗。排除掉這一部分,離實驗成功至少又近了一步。歡迎索取Collibri文庫制備產品的詳細資料或有關NGS的技術指南,不斷晉級成為NGS領域的大咖!

(生物通 余亮)

參考文獻

1. Kimberly Robasky, Nathan E. Lewis & George M. Church. The Role of Replicates for Error Mitigation in Next-Generation Sequencing. Nat Rev Genet. 2014 Jan; 15(1): 56–62.

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