Arraystar表觀轉錄組芯片應用案例

——短暫局部性腦缺血顯著改變小鼠大腦中RNA的m6A修飾水平

【字體: 時間:2019年12月11日 來源:康成生物

編輯推薦:

  近期,美國威斯康星大學(麥迪遜分校)Raghu Vemuganti教授實驗室利用Arraystar mouse mRNA&lncRNA表觀轉錄組芯片 ,首次發現在小鼠短暫局部性缺血12小時并再灌注后,122個mRNA和17個lncRNA的m6A修飾水平上升,15個mRNA和3個lncRNA的m6A修飾水平下降。

美國威斯康星大學(麥迪遜分校)Raghu Vemuganti教授長期從事ncRNA及腦損傷相關研究。近期,其實驗室利用Arraystar mouse mRNA&lncRNA表觀轉錄組芯片 ,首次發現在小鼠短暫局部性缺血12小時并再灌注后,122個mRNA和17個lncRNA的m6A修飾水平上升,15個mRNA和3個lncRNA的m6A修飾水平下降。通過GO/pathway分析發現m6A修飾水平變化的mRNA顯著富集到炎癥、細胞凋亡和轉錄調控等生物學過程。m6A修飾水平的變化可能是由去甲基化酶FTO表達下調引起。該研究成果于2019年8月發表在Stroke (IF: 6.046)。

康成生物丨數譜生物是Arraystar中國區唯一代理商,獨家為您提供從樣品到數據分析的全程一站式技術服務。

研究背景
缺血性腦卒中后神經元的命運由一系列復雜的生化和分子事件決定,包括興奮性毒性、離子失衡、氧化應激、內質網應激、細胞凋亡和炎癥等。缺血敏感性轉錄組的迅速改變可以促進這些過程的發生。此外,RNA的轉錄后水平調控可以精細調節缺血后病理生理變化,如非編碼RNA、RNA結合蛋白和表觀轉錄后修飾等。最近的研究表明,RNA上存在一百多種不同的化學修飾,可以在轉錄后水平調控RNA,其中m6A是含量最豐富的化學修飾,可以調控mRNA的剪接、運輸、定位、翻譯和降解。在哺乳動物細胞中,甲基轉移酶METTL3、METTL14和WTAP催化m6A修飾的形成。而去甲基化酶FTO和ALKBH5介導去甲基化。而且FTO在腦中高度富集,其缺失導致多巴胺能神經元神經傳遞受損和先天性小頭畸形。近期研究表明心肌缺血可導致控制心肌細胞收縮功能mRNA的m6A修飾水平上升。m6A修飾在哺乳動物腦中豐度最高,可以調控突觸可塑性、軸突生長、學習記憶和應激反應。但m6A修飾缺血性腦損傷中的作用尚不清楚,為此文章作者檢測了短暫局部性腦缺血對mRNA和lncRNA上m6A修飾的影響。

技術路線

結果展示

1. 預實驗:dot blot證明短暫局部性缺血后m6A修飾總體水平升高。

為探究小鼠大腦短暫局部性缺血后,m6A修飾總體水平的變化,作者分別選取缺血3h、6h、12h和24h時雄性小鼠和對照小鼠大腦進行dot blot實驗,發現12h和24h時,m6A水平明顯上升。在雌性小鼠中,短暫缺血24h時,m6A水平顯著上升。


圖1. 小鼠大腦短暫局部缺血后m6A水平明顯上升(雄性:12h和24h時,雌性:24h時)。

2. 高通量篩選:Arraystar mouse 表觀轉錄組芯片證明短暫局部性缺血后顯著改變特定RNA的m6A修飾水平。

確定短暫局部性缺血可導致RNA m6A總體水平顯著升高后,作者利用MeRIP和Arraystar 表觀轉錄組芯片,檢測了短暫局部性缺血12h時小鼠大腦中mRNA和lncRNA的m6A修飾水平。芯片共檢測到44122個mRNA轉錄本和12496個lncRNA轉錄本,其中127個mRNA和20個lncRNA的m6A水平發生顯著變化。其中95% RNA(122個mRNA,17個lncRNA)的m6A修飾水平明顯上升,只有5% RNA(5個mRNA,3個lncRNA)的m6A修飾水平下降。然后作者選取6個mRNA和2個lncRNA 分子,利用MeRIP-qPCR檢測了m6A修飾水平的變化,結果與Arraystar表觀轉錄組芯片結果相符。

 
圖2. 短暫局部缺血后m6A修飾水平上升的mRNA及lncRNA明顯多于修飾水平下降的RNA。


圖3. 利用MeRIP-qPCR驗證4個m6A修飾上升的RNA(A)和4個m6A修飾下降的RNA(B)。m6A的reader蛋白YTHDF1和YTHDF3在短暫缺血24h時表達上升(C)。

3. 生信分析:m6A修飾發生明顯變化的RNA顯著富集到炎癥、細胞凋亡和轉錄調控等生物學過程。

為確定m6A修飾發生明顯變化的mRNA的功能,作者進行了GO/pathway分析,發現相關mRNA顯著富集到炎癥、細胞凋亡和轉錄調控等生物學過程,細胞因子活性、蛋白酶結合、轉錄激活因子和轉錄抑制因子活性等分子功能,以及GPCR信號、細胞因子信號、腫瘤壞死因子(TNF)信號等KEGG通路,已有研究表明這些通路可以調控缺血性腦損傷。m6A修飾水平的變化可能影響了mRNA的翻譯和lncRNA的功能,進而影響了腦缺血后細胞的命運。


圖4. 對m6A修飾發生顯著變化RNA的GO/pathway分析結果。

4. mRNA qPCR/WB:去甲基化酶FTO在短暫缺血后表達下調。

為確定m6A修飾水平上升的原因,作者分別檢測了短暫缺血后m6A writer、reader和eraser的表達量,發現reader基因YTHDF1和YTHDF3只在缺血24h時表達上升,writer基因METTL3、METTL14和 WTAP的表達量不變,eraser基因FTO表達顯著下降。免疫染色實驗表明FTO主要在神經元中表達。說明m6A修飾水平的升高可能是由去甲基化酶FTO表達下調引起。


圖5. 短暫缺血后FTO的mRNA(A)和蛋白(B)表達以及酶活性(C)均下降。


圖6. FTO主要在神經元中表達。NeuN+是神經元細胞標志性蛋白,GFAP+是星形膠質細胞標志性蛋白,IBA1+是小膠質細胞標志性蛋白。

研究意義

該課題組借助Arraystar表觀轉錄組芯片檢測了小鼠短暫局部性腦缺血后mRNA和lncRNA上m6A修飾水平的變化。發現m6A修飾發生變化的RNA中大多數是修飾水平上升的,這些RNA顯著富集到炎癥、細胞凋亡和轉錄調控等生物學過程。m6A修飾水平的變化可能是由去甲基化酶FTO表達下調引起。該研究首次表明小鼠腦卒中明顯改變RNA的m6A修飾水平,這可能對腦卒中后的病理生理學變化具有重要影響。

文章出處

Transient Focal Ischemia Significantly Alters the m6A Epitranscriptomic Tagging of RNAs in the Brain

我來說兩句
0  條評論    0 人次參與
登錄 注冊發布
最新評論刷新
查看更多評論 > >

訂閱生物通快訊

訂閱快訊:

最新文章

限時促銷

會展信息

關注訂閱號/掌握最新資訊

生物通首頁 | 今日動態 | 生物通商城 | 人才市場 | 核心刊物 | 特價專欄 | 儀器龍虎榜

版權所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

聯系信箱:

粵ICP備09063491號

幸运飞艇最新群二维码 福彩3d绝杀6码走势图 腾讯分分彩计划 精 海南4+1开奖官网 多种形式多种黑马股票推荐 快乐十分任三诀窍 比pc蛋蛋好 上证指数历史走势图最新 山东十一选五开奖结果 新疆体彩十一选五开奖结果 排列三走势图方法技巧