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12款亞硫酸氫鹽轉化試劑盒,誰表現更出色?[心得點評]

【字體: 時間:2018年06月21日 來源:生物通

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  比利時根特大學的研究人員近日評估了12種亞硫酸氫鹽試劑盒的表現。他們綜合利用凝膠電泳、定量PCR、數字PCR以及新一代測序(NGS)等方法,尋找這些試劑盒之間的差異。評估結果于上周發表在《PLOS One》上。

DNA甲基化作為一種重要的表觀遺傳修飾,調節著許多生物學過程。研究這種修飾的金標準方法是亞硫酸氫鹽測序。為此,多家公司推出了亞硫酸氫鹽轉化試劑盒。這些試劑盒在轉化效率上表現不錯,但DNA損失和DNA片段化等問題仍讓人苦惱。

針對這些問題,比利時根特大學的研究人員近日評估了12種亞硫酸氫鹽試劑盒的表現。他們綜合利用凝膠電泳、定量PCR、數字PCR以及新一代測序(NGS)等方法,尋找這些試劑盒之間的差異。評估結果于上周發表在《PLOS One》上。

亞硫酸氫鹽處理的方法于1992年最早提出,到現在仍然是分析DNA甲基化的金標準。它的原理大家都清楚,亞硫酸氫鹽處理使未甲基化的胞嘧啶(C)轉化為尿嘧啶(U),而甲基化的胞嘧啶(mC)保持不變,之后可通過測序分析甲基化圖譜。盡管廣泛使用,但這種方法也有缺點?量痰姆磻獥l件會造成DNA片段化和降解。

在這項研究中,研究人員評估了市場上12種亞硫酸氫鹽試劑盒的表現,重點關注DNA片段化。這些試劑盒包括Zymo Research的EZ Gold和EZ Lightning,QIAGEN的Epitect和Epitect Fast,默克密理博的CpGenome、Epigentek的Bisulflash和Bisulflash Easy等。

研究人員利用光譜測定(Qubit 2.0熒光計)和dPCR來確定DNA產量,利用凝膠電泳、qPCR和dPCR來評估DNA降解,并利用新一代測序來確定轉化效率。他們發現這些試劑盒存在明顯的差異。

以DNA片段化為例,凝膠電泳分析檢測到Epitect和CpGenome試劑盒存在較大片段,說明它們的片段化程度最低。利用qPCR對88 bp至476 bp的片段進行擴增時,發現Epitect和CpGenome試劑盒的Cq值最小。同樣地,dPCR通過絕對定量,發現這兩款試劑盒中的DNA濃度最高。由此可見,這兩款試劑盒造成的DNA片段化最少。

在DNA回收率方面,EZ Gold試劑盒表現最佳,而同一家公司的EZ Lightning試劑盒卻排名第六。研究人員認為,既然這兩種試劑盒采用了相同的DNA脫璜和DNA純化,那么影響DNA回收率的可能是轉化緩沖液和轉化條件。

至于哪個試劑盒是最佳的亞硫酸氫鹽轉化試劑盒,研究人員認為這要取決于具體實驗。對于DNA長片段的甲基化研究,Epitect試劑盒是理想之選,因為它造成的片段化最少。在分析短片段時,則要考慮其他因素:如果DNA數量有限,需要高回收率,則EZ Gold似乎是更好的選擇。(生物通 薄荷)

原文檢索

Kint S, De Spiegelaere W, De Kesel J, Vandekerckhove L, Van Criekinge W (2018) Evaluation of bisulfite kits for DNA methylation profiling in terms of DNA fragmentation and DNA recovery using digital PCR. PLoS ONE 13(6): e0199091. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199091

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