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你以為做完m6A測序后就完了?m6A-IP-qPCR了解下!

【字體: 時間:2018年05月21日 來源:聯川生物

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  所謂m6A-IP-qPCR也叫MeRIP-qPCR,即利用m6A抗體在富集到帶甲基化修飾的RNA后,下一步使用qPCR直接對富集到的RNA進行定量的一種技術。

今天的文章將圍繞m6A測序后必須要了解的一種定量技術——m6A-IP-qPCR(也叫MeRIP-qPCR)。

所謂m6A-IP-qPCR也叫MeRIP-qPCR,即利用m6A抗體在富集到帶甲基化修飾的RNA后,下一步使用qPCR直接對富集到的RNA進行定量的一種技術。

這種技術可以做到對發生甲基化的RNA進行相對定量,是一種低成本的檢測方法,僅需m6A抗體,A/G免疫磁珠,磁力架和qPCR儀及配套試劑盒即可開展這類實驗。

第一步:提取total RNA,作為可選步驟可以用OligodT磁珠富集帶polyA尾的mRNA。
第二步:將A/G免疫磁珠和m6A抗體按照試劑盒的標準步驟進行預混,配制免疫磁珠抗體預混液。
第三步:將預混好的免疫磁珠m6A抗體加入total RNA或mRNA中,若RNA上的腺嘌呤上帶有m6A甲基化修飾,則m6A抗體會與之相結合。
第四步:采用磁力架對m6A免疫磁珠進行富集。
第五步:用蛋白酶對富集到的RNA-抗體復合物進行消化,m6A抗體被消化完后只剩下RNA。
第六步:進入常規的qPCR的步驟。

當然這里需要注意的是,這類實驗僅僅是對發生RNA甲基化的基因進行相對定量檢測,甲基化程度高應該還要和基因本身的轉錄水平相結合。MeRIP-qPCR還需要結合其他實驗,如常規的qPCR、WB等才能從多個角度來驗證,最終得到想要的結果。

今天的內容分享完啦,大家記得收藏好慢慢學習哦~

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