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技術指南:高通量表觀遺傳學分析

【字體: 時間:2018年01月04日 來源:生物通

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  幸運的是,科學家們發現了越來越多表觀遺傳學的分子機制,這其中部分歸功于技術的發展,全基因組測序技術能幫助研究人員繪制了整個基因組中出現的表觀遺傳變化,而高通量方法如液相色譜和質譜,也可以同時追蹤數百種代謝物的變化。

生物通報道:“釘”在DNA或組蛋白上的化學基團具有重要的意義,能調節基因表達的方式和時間。研究發現環境信號可以改變這些表觀遺傳標記的位置,但是目前研究人員難以確定飲食,炎癥或社會壓力等現象是如何轉化為調節基因功能的信號的。

經過幾十年的研究,科學家們已經發現某些新陳代謝如何產生表觀遺傳效應,例如,在糖或蛋白質消化過程中形成的分解產物可以轉化為化學標記,表觀遺傳修飾DNA或組蛋白。但是,即使是將葡萄糖轉化為細胞燃料這樣基礎性的過程,也可以通過不同的途徑發生,這些途徑會基于細胞的直接環境和狀態而發生動態變化。因此,癌細胞和健康人細胞可能會以不同的方式消化糖,從而出現不同的代謝物,制造出的表觀遺傳標記也不同。

了解哪些代謝物可以調控基因功能,以及是否通過表觀遺傳方式,與轉錄因子還是其他途徑結合,這些都是研發更好藥物的關鍵所在。

幸運的是,近期研究人員發現了代謝如何改變表觀遺傳學的機制,這其中部分歸功于技術的發展,全基因組測序技術幫助研究人員繪制了整個基因組中出現的表觀遺傳變化,而高通量方法如液相色譜和質譜,也可以同時追蹤數百種代謝物的變化。

此外,最近的研究也揭示了異常代謝與癌細胞表觀遺傳變化之間的聯系,由此科學家們開始分析代謝變化是否會推動表觀遺傳變化。來自杜克大學的癌癥研究專家Jason Locasale說:“這兩個領域此前一直都是分開研究的。在過去的十年中,癌細胞和發育生物學中觀察到的不同代謝變化融合在一起,導致了這些新研究的出現!

The Scientist介紹了多項相關的研究和技術,希望能幫助大家了解目前這一領域的進展。

T細胞切換

研究者:李銘(Ming Li),紀念斯。瓌P特琳癌癥中心的免疫學家 (延伸閱讀:專訪李銘:在未知世界中徜徉探索

研究項目:糖如何調控T細胞激活


首先形成胰腺腫瘤的細胞(左圖)顯示出高水平的組蛋白甲基化(紅色)。轉移到遠端(如肝臟)癌細胞中的甲基化會丟失(右圖)

問題:細胞通常在含氧的情況下將糖消化分解成二氧化碳和水。但是癌細胞和活化的T細胞是通過不同的途徑輸出葡萄糖的,其中一種途徑是有氧糖酵解,葡萄糖被轉化為3-碳酸乳酸酯分子,后者一般是在厭氧過程中產生(即使有氧氣存在)。盡管這種消化過程是活化T細胞的標志,而且會影響促炎基因的表達,但是科學家們至今并不清楚,為何細胞會采用這種代謝途徑。

為此,李銘等人構建了一個乳酸脫氫酶A(LDHA)缺陷的T細胞小鼠系,LDHA催化了有氧糖酵解的關鍵步驟之一。結果他們發現,突變的輔助性T細胞比野生型細胞所消耗的葡萄糖少大約70%,并且表達的干擾素γ(IFNγ)水平也低。此前這一組研究人員曾報道,阻斷有氧糖酵解能增加另一種酶與IFNγ mRNA轉錄物 3'非翻譯區(UTR)的結合,從而降低了這種基因的翻譯。但是當李銘研究組刪除了3'UTR的時候,抑制有氧糖酵解仍然降低了IFNγ的表達。也就是說LDHA在翻譯階段沒有發揮作用,而是促進了基因的轉錄。

為了尋找基因表達和糖代謝之間的其它聯系,研究人員利用染色質免疫沉淀(ChIP-Seq),發現野生型和LDHA敲除細胞具有不同的組蛋白乙;突虮磉_模式(組蛋白乙;ㄟ^令DNA更接近轉錄因子,從而促進基因表達)。在敲除小鼠中,86%的下調基因(包括IFNγ)都出現了組蛋白乙;瘻p少。當LDHA誘導有氧糖酵解能量產生時,線粒體(促進細胞活性的細胞器)就會控制呼吸,產生乙酰輔酶A,乙酰輔酶A是乙;M蛋白所需的輔助因子。這樣細胞就能恢復組蛋白乙;虸FNγ表達,說明有氧糖酵解是通過表觀遺傳機制來控制干擾素表達的(Science,354:481-84,2016)。

目前這一研究團隊正在尋找其他具有類似調控機制的炎癥細胞因子。李銘說:“IFNγ是用于區分表觀遺傳學基因調控和翻譯機制的一個準確模型。

方法技巧:如果需要闡明代謝物在表觀遺傳效應中的作用,可以尋找DNA甲基化或組蛋白乙;忍厥庾兓,然后再尋找產生這些標記可能所需要的成分的代謝途徑。

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癌癥化學

研究者:范德堡大學病理學家Oliver McDonald

研究項目:葡萄糖代謝物如何調控癌癥轉移相關的基因

問題:胰腺導管腺癌是胰腺癌最常見的形式,這種癌癥的原發性腫瘤和轉移性細胞在遺傳上非常相似。但是轉移細胞生活在比原發腫瘤更為豐富的營養環境中,并以不同的方式生長。目前對于轉移性細胞擴散和生長的基因調控,科學家們并不清楚。不過這些細胞的基因組中出現了大范圍的去甲基化跡象,這說明其中存在表觀遺傳機制。

為此McDonald研究小組花了一年時間敲除了小鼠腫瘤中各種染色質修飾機制,但沒有任何結果,由此他們提出了另一種假設:這種大范圍表觀遺傳變化受到同樣大范圍代謝變化的調節。

當研究人員比較原發性和轉移性人類腫瘤樣品中的甲基化組蛋白時,他們發現來自遠端部位,如肝和肺的轉移細胞的組蛋白上攜帶有不同的甲基化和乙;瘶擞。與原發性腫瘤(可以用不同的“代用燃料”補充或代替葡萄糖)不同,轉移性癌細胞非常依賴于葡萄糖消耗來形成腫瘤。因此,研究人員利用液相色譜和高分辨率質譜追蹤轉移后糖代謝途徑,尋找癌細胞可能最依賴的途徑。

結果他們在腫瘤代謝物譜分析中發現,遠端轉移的腫瘤會比局部轉移的腫瘤消耗更多的葡萄糖,遠端轉移的腫瘤細胞及其祖細胞能夠通過戊糖磷酸途徑對葡萄糖進行代謝從而促進生長,6-磷酸葡萄糖酸(6PG)水平顯著降低,6PG是通過6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(PGD)進一步分解的,這表明這種酶過度活躍,消耗了其全部底物(Nat Genet,49:367-76,2017)。

敲除PGD基因并不會改變同一途徑中其他酶的表達,但是能逆轉遠端轉移細胞中染色質甲基化和乙;淖兓。抑制這種酶阻斷了3-D培養物中的腫瘤形成。因此,PGD也許是一種營養物質感應機制的關鍵:通過不斷降低6PG水平,迫使細胞消耗更多的葡萄糖。然后,細胞通過消化葡萄糖調配過量代謝產物,乙;蛉ゼ谆瘣盒约毎枞旧|區域中的組蛋白,形成腫瘤,引起轉移生長中出現大規模表觀遺傳學改變。

McDonald說,“我們不知道PGD信號如何靶向這些位點。這可能是通過預先結合到這些區域的轉錄因子實現的”。當研究人員在實驗中敲除腫瘤形成細胞的PGD時,原發性腫瘤細胞仍然生長,但是轉移性細胞生長會停滯。

方法技巧:McDonald依靠人工篩選數據,發現了代謝物水平和染色質變化之間的聯系。像是那些在轉移性胰腺癌中發生改變的染色質結構域,可能會出現數百種不同的信號和代謝物水平(由于存在許多不同的細胞途徑)。例如,葡萄糖可以通過幾種途徑被消化,并且每種都會產生不同的中間體。

“所以生物信息學程序可能不能檢測到所有有趣的變化,”McDonald說,“通過人工將代謝物數據錄入到電子表格中,這樣我們才發現了PGD,因為幾個不同的樣品中都沒有出現它!

對于那些沒有辦法手動分析的研究人員,McDonald建議找到可能與被研究疾病相關的代謝物模式,然后與生物信息學家一起定制算法,以便找到個體化生物學特征。

 


干細胞穩定性

研究人員:杜克大學藥理學家和癌癥生物學家Jason Locasale

研究項目:了解甲硫氨酸如何影響胚胎干細胞中的組蛋白甲基化

研究:甲硫氨酸是一種必需氨基酸,這意味著它必須由膳食蛋白質提供。同時甲硫氨酸也是制造S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的組成成分,SAM是一種有助于DNA和組蛋白甲基化的分子。

Locasale開始時分析甲硫氨酸代謝,是為了了解細胞如何感知代謝變化,以及它們是否可以將這些信息傳達給染色質。在最近的一項研究中,這一研究小組報告說,一種調控胚胎干細胞甲硫氨酸代謝的高度保守哺乳動物酶:SIRT1,也可以調控分化的表觀遺傳標記。

當研究人員在小鼠胚胎干細胞中刪除或敲除SIRT1時,突變細胞的甲硫氨酸含量就會升高,但SAM水平較低,因此許多組蛋白甲基化標記丟失,導致多能性喪失。但其它SIRT1活動未受影響。研究人員認為干細胞喪失多能性是因為將甲硫氨酸轉化為SAM的酶受到了SIRT1的控制(EMBO J,36:3175-93,2017)。

Locasale說:“我們知道SAM和乙酰-CoA通過酶與染色質相互作用,建立這些表觀遺傳修飾,但是它發生的程度以及如何發生的依然未知!

方法技巧:為了研究哪些氨基酸代謝途徑受到SIRT1敲除的影響,Locasale研究組采用了高分辨質譜,這樣他們就能在不到一個小時的時間內測量數百種代謝物的濃度。然后,他們通過一種算法分析這些數據,將實驗中的代謝物與代謝物的標準化庫進行比較,推斷營養物質如何從一種代謝途徑流向另一種代謝途徑。

研究人員還將質譜得到的數據進行了多重分析:測量在給定時間點與染色質反應的所有代謝物,識別所有對甲硫氨酸水平變化有反應的代謝物,檢測代謝中有多少突變導致了染色質的變化。 Locasale說:“當我們詳細了解了代謝物水平,就可以快速的檢測各種假設,產生更多的可能。十年前,這樣的工作需要花費許多的時間和精力!

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參考文獻:

Aerobic glycolysis promotes T helper 1 cell differentiation through an epigenetic mechanism ,Science,354:481-84,2016

Epigenomic reprogramming during pancreatic cancer progression links anabolic glucose metabolism to distant metastasis,Nat Genet,49:367-76,2017

Methionine metabolism is essential for SIRT1‐regulated mouse embryonic stem cell maintenance and embryonic development,EMBO J,36:3175-93,2017

(生物通:張迪)

 

 

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