Western Blot實驗操作進階技巧

【字體: 時間:2015年05月08日 來源:生物通

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  近年來Western blot技術也有了一些發展,一些新的試劑和儀器令Western更為敏感,一些主要步驟(電源,轉膜等)也更為精簡,雖然許多研究人員仍然使用的是化學發光法檢測法和X光膠片,但一些新的技術,如數字熒光成像技術已經提高了這種工具的敏感性和可靠性,令其進入了“定量時代”。一些新的技術方法也能令Western blot可以用于單細胞檢測,或者對有限及珍貴的樣品進行檢測,其中的一些步驟也實現的自動化。

——小叮當口袋里的各種法寶令Western blots操作更快,更敏感,也更可靠

生物通報道:除非是Western blot實驗方面的高手,要不就像在我看來,Western blot發展至今好像與其1979年剛被發明出來的時候一樣一樣,同樣也是根據蛋白不同的大小(或電荷)進行電泳分離,然后轉膜,利用抗體篩選出目標蛋白。

多年來這種技術已經成為了蛋白研究方面的一種主要技術,研究人員可以利用Western blot定性,甚至半定量的識別組織和培養細胞中的蛋白,這種操作實驗可以說每天都會在實驗室里上演,但同時,Western blot等blot技術也是各種審議的主題,學術造假,以及一些研究成果被退回的原因。

近年來Western blot技術也有了一些發展,一些新的試劑和儀器令Western更為敏感,一些主要步驟(電源,轉膜等)也更為精簡,雖然許多研究人員仍然使用的是化學發光法檢測法和X光膠片,但一些新的技術,如數字熒光成像技術已經提高了這種工具的敏感性和可靠性,令其進入了“定量時代”。一些新的技術方法也能令Western blot可以用于單細胞檢測,或者對有限及珍貴的樣品進行檢測,其中的一些步驟也實現的自動化。

減少樣品量

過去幾年里,研究人員已經邁出了檢測單個細胞中DNA 和 RNA的重要一步,相比之下,蛋白檢測已經落在后面。蛋白抗體質量不過關是主要的原因,這限制了研究人員在使用流式細胞儀和免疫細胞化學方法進行單細胞蛋白水平檢測的精確度。而且Western blot實驗需要分離得到蛋白,然而迄今為止這在單細胞中還無法做到。

來自加州大學伯克利分校的生物工程研究組Amy Herr等人研發出了一種新型的微流控設備:scWestern (即single-cell Western),這種設備可以幫助研究人員在四小時內完成大約2000 個體細胞的Western實驗。

從結構上來說,scWestern 包被有30-μm厚的光敏聚丙烯酰胺(PA)凝膠,而芯片上共有6720個微孔。這些微孔的直徑為20 μm,是在聚丙烯酰胺凝膠聚合時形成的。

從設計原理上來說,scWestern實現了高度平行的分析,而不需要單獨獲取每個細胞。通過被動重力驅動的細胞設置,細胞懸液接種到微孔中,每個微孔在5-10分鐘內捕獲0-4個細胞。而且研究人員通過優化短分離距離的聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE),實現了高密度的scWestern芯片。在細胞裂解后電泳開始,他們在浸沒的scWestern玻片上應用電場,電泳蛋白穿過微孔壁,進入薄的凝膠層。其次這一設備利用了反應(蛋白質固定)和運輸(抗體雜交)的小特征長度。在PAGE之后,蛋白質與PA凝膠交聯。之后進行抗體雜交和檢測。

研究人員應用這種方法來研究體外刺激下的干細胞信號和分化反應,結果發現scWestern能定量每個單細胞中最多11種目標蛋白,在與FACS整合時,支持稀有或珍貴細胞(~200個)的分析。

如何入門:

雖然這項技術是全新的,但是一般來說通過多次練習,剛畢業的學生在一個月內就能掌握這種技術,Herr說。

同時Herr也與Zephyrus Bioscience公司合作,計劃于明年推出相關的自動化設備。

注意事項:

不過需要注意的是這種技術有兩個限制。其一是細胞裂解后,蛋白會從微孔中漏出,造成高達40%的損失。其次是分離度欠佳,研究人員無法區分質量相差至少一半的蛋白。Herr研究組目前正努力解決這兩個問題,“我想我們已經有了一些令人高興的結果,”她說。

微western芯片分析技術(Microwestern,生物通注),比如Herr的“μWesterns”(scWestern之前的一個成果,比scWestern孔徑大)則能幫助那些進行細胞群體研究,而不是單細胞研究的研究人員,這種方法是在一個96孔板上將細胞裂解液放到96個微小的凝膠塊中,具體過程可以通過YouTube視頻來看(www.igsb.org/services/mwac-methodology)。微western芯片分析能區分質量相差75kD的蛋白(蛋白質量超過200kD),同樣也需要piezoelectric dispenser,而這并不便宜。

費用:

相關儀器的價格待定,如果你需要制造自己的 scWestern,那么就需要花費幾千美元(其它材料準備充分),而微western芯片的價格則為每次1,800美元(當地價格)——96個抗體檢測六種細胞裂解液。

 

實驗操作加速

從開始到結束,傳統的Western blot操作需要大約兩天半的時間,如果還要重做,加上樣品量很大的時候,真是會讓人崩潰。“我要做許多WB實驗,檢測所有的樣品,這真是費時費力,”來自加州大學舊金山分校的博士后研究員Jillian Silva說。

為此Silva修改了Western blot的實驗操作流程,讓時間縮短到一天完成。首先她將SDS-PAGE 凝膠換成了Bis-Tris 系統,這樣跑膠的時間就縮短到了35分鐘(而PAGE膠需要1.5-2個小時),并且這一系統也能提高檢測的靈敏度。其次Silva購買了一套新的blotting系統,也就是 iBlot 系統——能在7分鐘內完成轉膜,而傳統方法需要1-2個小時。(大家可以 在此處咨詢相關國內技術人員 >> >>)

第三,也就是最重要的一點,她采用了不同于傳統化學檢測方法的熒光檢測方法:LI-COR的 Odyssey系列產品,這一系統采用近紅外熒光技術,降低背景熒光,提供比可見光譜熒光更高的信噪比,且靈敏度與化學發光相當,而且升級后的Odyssey增添了自動掃描功能,無需摸索激光強度。

歡迎索取Odyssey檢測系統的詳細資料

從使用感受上來說,Silva說這一系統有兩個激發波長:700nm和800nm,所以可以在同一個膜上檢測兩種不同的蛋白,“這一點用處很大,因為這樣我就能同時跑兩種不同蛋白了,”她說。

如何入門:

Silva 和其他幾個實驗室共享了她的實驗操作方法,一些實驗室也發表了相關的論文(the Journal of Visualized Experiments ,e51149, 2014),剛開始他們還有些猶豫,不想采用熒光檢測的方法,但是一旦開始用上了這種方法,就會愛不釋手了。不過在最開始上手的時候,還需要一些調整,如緩沖液的用量,抗體溫孵的時間等,她表示這些都有助于提高速度和靈敏度。

費用:

每個Bis-Tris 膠為 14.50美元(當地價格),iBlot 2 Gel Transfer Device設備為1,996美元(當地價格),LI-COR Odyssey Infrared Imaging System價格為3-6萬美元(當地價格),國內價格請具體詢問各廠家。在此處咨詢相關價格>> >>

注意事項:

時間節省來自于成本的增加,Silva 估價稱大約每次實驗要多花費20美元(當地價格),但是如果考慮到人員成本、動物維護費用等等的時間和精力,而且熒光成像無需化學顯影,定影等相關的費用(在Silva的實驗室這個花費約為324 美元/年),Silva覺得還是劃得來的。


總蛋白內參

研究人員為了能定量分析目標蛋白,一般來說都會將其與溶液中的其它單一蛋白進行比對,如GADPH、 β-肌動蛋白或微管蛋白等,這些蛋白的表達水平量一般認為是維持不變的。

但是近年來的研究表明,這些所謂的上樣內參在同一組織的不用位置,以及出現疾病的情況下也會發生變化,而且差異可以高達20%(PLOS ONE,8:e72457,2013年)。在這篇文章中,研究人員檢索了已發表的芯片數據和質譜數據,發現常用的細胞骨架蛋白(actin,actinin和各種tubulin異構體)、線粒體蛋白(VDAC1和VDAC2)和細胞核蛋白(HC1)都存在差異表達。

“許多大家用作上樣內參的蛋白……其實并不穩定,它們在許多不同的神經退行性疾病情況下都發生了改變,”來自英國愛丁堡大學羅斯林研究所研究員Thomas Wishart說。

為此,Wishart研究組修改了傳統的方法,將他們的目標蛋白與同樣條道的總蛋白水平進行比對,結果發現這是更為可靠的一種方法。首先研究人員同時跑兩塊膠,并將其中的一塊用考馬斯亮藍染料浸泡。然后他們通過數字圖像處理軟件,檢測整條道中的蛋白信號。

(研究人員發現作為對照的單個看家蛋白實際上也會發生變化,因此分析樣品中的總蛋白濃度(黃色框標識)是定量蛋白的更好內參)

如何入門:

Wishart的方法,以及相關的故障排除Tips都發表在了一篇論文中:A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies。Wishart說,當然多跑一塊膠會導致其它問題的出現,但只要你上樣單μL的量,那就不成問題。這種方法還能通過BCA或者其它蛋白檢測方法分析蛋白濃度,交叉檢查考馬斯亮藍染色結果。

費用:

Wishart的方法會增加實驗成本,跑膠,染色大約會增加20%的成本,但是“實際上從長遠來看這能節約錢,因為你從一開始就不會做錯,不用重來,”他說。

注意事項:

如果你還是希望用單個蛋白作為內參,那么可以找一下蛋白質組的數據(質譜數據),看看有哪些蛋白水平變化小,更為可靠一些。

傻瓜Western blot操作系統

Western blot技術發展至今,其繁瑣的步驟其實并沒有多大變化,雖然通過一些科學家們的優化,這些步驟有了些變化,但手工步驟越多,出錯的幾率也越大。因此研究人員希望能自動化這一過程。

美國加州的一家公司:ProteinSimple 推出了一種與眾不同的Western blot操作系統,這一系統采用基質填充毛細管電泳,替代傳統的凝膠,研究人員只需將樣品、一抗、二抗和檢測試劑加入微孔板,按下Start就行了,幾個小時后就能得到完全分析好的數據了。

2011年,該公司推出了第一臺傻瓜Western blot操作系統:Simon,2014年,ProteinSimple又推出的全新的儀器——Wes,這臺儀器能在不到3個小時內完成25個樣品的分析,此外還有另外兩臺名為Sally Sue 和 Peggy Su的高通量儀器,這兩臺儀器每次能分析96個樣品,上樣量僅需0.2 μg/μ L 裂解液。

“除了提升了實驗的可重復性和結果一致性,這一系統最大的優點在于能分析數量十分有限的樣品,”來自斯坦福大學醫學院的Joanna Liliental說,她的實驗室采用了Peggy Sue,以及電荷分離 NanoPro 1000,“電荷分離分析依賴于細胞中靶標蛋白的豐度,這種技術能定量僅僅25個細胞中的蛋白信號,標準Western是不可能完成這樣的實驗。”

費用:

Wes的定價標準定位于“高端成像系統”,Simple Western產品總監Patricia Piatti說,這一系統的耗材要比傳統Wsetern更貴,但平均成本差不多,Piatti表示。

如何入門:

Simple Western的儀器需要添加一些內核,同時儀器使用也需要培訓,一般來說要培訓四個小時,并且在幾個星期的使用后才能流暢操作這些儀器,而且軟件使用也要花時間掌握。

注意事項:

與任何Western Blot實驗一樣,抗體質量是一個限制因素。ProteinSimple 和它的姊妹公司Bio-Techne 正在嘗試驗證那些能用于儀器的抗體,“這是一個正在進行的項目,我們將會在已有的抗體列表中添加上新的內容,”Piatti說。

(生物通:張迪)

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